2月15日，國際期刊《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）在線刊發(fā)了化學(xué)與化工學(xué)院鐘芳銳教授團(tuán)隊(duì)完成的最新研究成果“拓展銅酶雜泛性催化吲哚氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)”（Expanding Promiscuity of a Copper-Dependent Oxidase for the Enantioselective Cross-Coupling of Indoles, DOI: 10.1002/anie.202219034）。該論文報(bào)道了首例銅外排氧化酶(CueO)催化吲哚類底物的氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，合成了一系列光學(xué)純2,2-二取代吲哚啉-3-酮類化合物。該反應(yīng)具有條件溫和、催化劑經(jīng)濟(jì)、選擇性高、底物普適性好等優(yōu)點(diǎn)，所制備的光學(xué)純吲哚3-酮衍生物ee值高達(dá)99%，并基于這些產(chǎn)物的生物活性篩選得到了兩個(gè)具有顯著抗腫瘤活性分子。
多銅氧化酶（MCOs）廣泛存在與自然界中，一般具有較低的底物特異性，可接納多種天然底物，其中主要類別是酚類化合物。MCOs通過單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制催化酚的氧化反應(yīng)，生成易二聚或寡聚的活性苯氧自由基，往往難以控制氧化反應(yīng)中間體的下游轉(zhuǎn)化。這種性質(zhì)導(dǎo)致單一漆酶催化酚類氧化偶聯(lián)反應(yīng)的選擇性不高，易形成多種區(qū)域異構(gòu)體和立體異構(gòu)體的混合物，立體化學(xué)的調(diào)控往往需要借助額外的輔助蛋白，這限制了多銅氧化酶的適用范圍。
鐘芳銳團(tuán)隊(duì)致力于綠色仿生和生物催化領(lǐng)域的研究，利用化學(xué)原理驅(qū)動(dòng)酶催化選擇性合成的理念，發(fā)展了含有非天然光敏活性基團(tuán)的人工光敏金屬酶（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 617）和“三重態(tài)光酶”（Nature, 2022, 611, 715）。基于銅催化氧化偶聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)機(jī)制，發(fā)展了多銅氧化酶催化的多酚氧化環(huán)加成反應(yīng)（Green Chem, 2022, 24, 5598.）。
針對(duì)上述問題，鐘芳銳團(tuán)隊(duì)提出了“金屬催化原理驅(qū)動(dòng)酶促非天然氧化交叉偶聯(lián)”的研究思路，基于銅離子的氧化還原性質(zhì)，將二價(jià)銅離子的“單電子催化氧化”機(jī)制與酶的“微環(huán)境效應(yīng)”相耦合，通過在酚類底物中引入額外的氫鍵供體/受體與酶的手性空腔形成有益的相互作用，成功實(shí)現(xiàn)了氧化偶聯(lián)反應(yīng)的對(duì)映選擇性調(diào)控（圖1）。
圖1. 多銅氧化酶不對(duì)稱催化氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)的設(shè)計(jì)思路
該研究建立的酶催化不對(duì)稱交叉偶聯(lián)具有較好的底物兼容性（圖2）。苯環(huán)上含有不同電子和立體性質(zhì)取代基的吲哚酚能順利發(fā)生預(yù)期反應(yīng)，收率為73-78％，立體選擇性一般都為99％ee。此外，不同位置取代的吲哚親核試劑、富電子類吡咯、1,3,5-三甲氧基苯和1,3-二甲氧基苯也同樣適用。親核試劑的范圍還可以進(jìn)一步擴(kuò)展到sp3雜化的碳親核試劑，如環(huán)狀和非環(huán)狀β-酮酸酯，相應(yīng)的產(chǎn)物均具有極好的立體選擇性。部分底物的放大實(shí)驗(yàn)（0.3-1.0 mmol）發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的產(chǎn)率和光學(xué)純度不受影響。
圖2. 代表性底物的結(jié)果
研究團(tuán)隊(duì)對(duì)該酶促反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了深入的研究（圖3）。首先通過控制實(shí)驗(yàn)捕獲和驗(yàn)證了中間體分子的生成。在此基礎(chǔ)上，通過銅的配位環(huán)境分析、中間體分子與酶的分子對(duì)接模擬等實(shí)驗(yàn)，提出了底物與酶的可能作用模型：中間體的酯基與CueO酶Asn240的酰胺N-H和Lys188的氨基存在著弱氫鍵作用；這些相互作用可能對(duì)交叉偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)性和對(duì)映選擇性至關(guān)重要。當(dāng)將這兩個(gè)氨基酸殘基突變成丙氨酸，所得突變體CueO_K188A和CueO_N240A的催化效果顯著降低。這一結(jié)果驗(yàn)證了上述推測(cè)的酶作用方式的合理性。
圖3. CueO酶催化的機(jī)理研究
相關(guān)文獻(xiàn)表明，2,2-二取代吲哚啉-3-酮類分子可能具有顯著的生物活性。作者利用MTT法測(cè)定了部分產(chǎn)物對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞系的毒性，得到了兩個(gè)顯著抗腫瘤活性的化合物3f和4a（濃度為50μM）。隨后的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)擬合得到了兩者的IC50值分別為34.31 μM和37.2 μM，均高于臨床藥物伊立替康和5-氟尿嘧啶（圖4），具有潛在的藥物應(yīng)用價(jià)值。
圖4. 部分化合物的細(xì)胞毒性測(cè)試
我校為論文的唯一完成單位，鐘芳銳教授是論文的唯一通訊作者。該論文第一作者為化學(xué)與化工學(xué)院2019級(jí)博士研究生郭歡。化學(xué)與化工學(xué)院2020級(jí)博士研究生孫寧寧為論文的共同第一作者。該項(xiàng)工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFA0903500）、國家自然科學(xué)基金（21602067）和湖北科技創(chuàng)新重大專項(xiàng)（2019ACA125）資助。
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